公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

RAPA3G DNA 聚合酶為經電子重構架的第三代 Taq DNA 聚合酶，第三代 DNA 聚合酶具有高度的雜質耐受性、 長片段擴增能力、高擴增成功率、高產量，這些特點使得 RAPA3G 系列產品可用于粗制樣品的直接擴增，無需核酸純 化步驟。該 PCR Mix 具有 5’-3’的聚合酶活性、5’-3’的外切 酶活性、3’-5’的外切酶活性，產物部分帶有"A“尾巴，部 分為平末端，因此產物可用于 TA 克隆或平端克隆。

特點和用途：
（1）高雜質耐受性：該 PCR Mix 可直接使用血液、蛋白含量較高的動物組織材料進行 PCR 擴增，無需基因組提取。
（2）高效的快速 DNA 釋放劑：盡管該 PCR Mix 可以直接使用組織細胞材料進行擴增，但我們仍然推薦采用 DNA 釋放劑進行樣本的快速前處理（約需要 5min，可高通量操作）。DNA 釋放劑的前處理，使得制備的 DNA 模板可以進行多次、多基因擴增，并長期保存 DNA，經 DNA 釋放劑處理的樣本，在室溫條件下放置 1 個月，無任何后續影響，-20 可長期保存。
（3）快速 PCR：該酶具有 6kb/min 以上的擴增速度，可顯著的縮短 PCR 的擴增時間，在常規測試條件下，10s 的延伸時間可完成 1kb 的基因組 DNA 擴增。
（4）粗制樣品的擴增能力：擴增能力>4kb。
（5）高保真性能：該制品包含一定比例的 RAPA HiFi 超保真 DNA 聚合酶，因此其具有一定的保真性能（經藍白斑測試，其保真性能約為 Taq DNA 聚合酶的 56 倍）。
（6）熱啟動，防止非特異性擴增：RAPA3G 系列產品均采用  專有的熱啟動技術，確保 50 度以下無活性，僅有 95 度加熱 5min 以后才能恢復其活性，因此可最大限度的提高擴增的特異性，減少非特異性產物的產生。
包裝：
2×RAPA3G PCR Mix (with Dye) 1ml×2
快速 DNA 釋放劑 A 20 ml
快速 DNA 釋放劑 B 20 ml
儲存：長期儲存置于-20°C 以下，可保存 2 年；短期使用置于 4°C（3 個月）保存。
使用方法
1. DNA 釋放
（1）采用加熱法：取 2-10 個毛發囊、1-10mg 動物組織等材料，放入到 0.2ml EP 管中，加入 50 μl 快速 DNA 釋放劑A，于 PCR 儀中 98°C 加熱 5min，加熱完畢后加入 50 μl快速 DNA 釋放劑 B，混合均勻，即可使用。
（2）采用鋼珠研磨法：取 1-10mg 動物組織等材料，放入到 2ml EP 管中，加入 250 μl 快速 DNA 釋放劑 A 和 2-3 粒鋼珠，研磨 1-2min 成漿體裝。研磨完畢后加入 250 μl 快速DNA 釋放劑 B，混合均勻，即可使用。
2. 按下表配制 PCR 反應體系并混合均勻：
2×RAPA3G PCR Mix (with Dye) 25 μl
上游引物(10 μM) 2 μl
下游引物(10 μM) 2 μl
步驟 1 制備的模板 DNA 2 μl
ddH2O 19 μl
注意：當擴增片段>5kb 時，引物用量調整為 0.25-0.5μl。
3. PCR 擴增循環參數
循環數 溫度 時間
預變性 95°C 5min
25-40 Cycles
95°C 20s
50~60°C 20s
72°C 4-6kb/min
末延伸 72°C 2min
請注意：（1）該制品為熱啟動制品預變性步驟 5min 不可縮短，否則 DNA 聚合酶無法恢復活性。（2）當擴增片段<1kb時，延伸時間使用 1-2kb="" 2-3kb="">3kb 時，請按照 2kb/min 的延伸時間進行設置。(3)盡管該酶具有 6kb/min 的延伸速度，但按照 2kb/min 設置延伸時間的條件下，能獲得最高的產量。
3. 注意事項：(1) 當模板 GC 含量>70%時，請添加5× Q-Solution。(2)當采用全血、血漿等蛋白含量的樣本時，擴增完畢后可能會有變性的蛋白沉淀，請離心后再進行點樣和電泳。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環節的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成，每個循環包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環數:

其他參數選定后，PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多，非特異擴增增加。

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